Opmerking: De inhoud van deze pagina komt uit de bijlagen bij de regionale besluiten (Brussels Hoofdstedelijk Gewest en Waals Gewest) over het ingeperkt gebruik van GGO's en/of pathogenen. Sinds de publicatie van deze besluiten (respectievelijk op 08/11/2001 en 04/07/2002) zijn sommige van de virale vectoren die op deze pagina worden beschreven, geëvolueerd naar een vorm die veiliger is om te gebruiken. Als gevolg daarvan zijn de inperkingsmaatregelen en werkpraktijken, die nodig zijn voor een maximale bescherming van de menselijke gezondheid en het milieu bij het hanteren van deze vectoren, waarschijnlijk geëvolueerd.
Algemene beginselen inzake indeling
Virale vectoren zijn virale partikels die in vergelijking met de virale stam waarvan de vector is afgeleid, een artificieel gemodificeerd genoom dragen.
De pathogeniciteit van vele gebruikte oudervirussen, de instabiliteit van de virale genomen en de mogelijke recombinaties met andere virussen of met andere sequenties van cellulaire oorsprong verplichten rekening te houden met bijzondere potentiële gevaren tijdens de productie en het gebruik van genetisch gemodificeerde virussen. Onder de potentiële gevaren worden als bijzonder ernstig beschouwd:
- mogelijke incidentele productie van een voor de mens, dier of plant zeer pathogene recombinante stam,
- de oncontroleerbare vermeerdering van een artificiële virale stam, welke haar pathogeniciteit ook;
- het gebruik van geneeskundige of industriële preparaten van virale vectoren gecontamineerd door niet- geïdentificeerde en/of niet-gedetecteerde virale soorten.
Gebaseerd op het behoud of het verdwijnen van het vermogen van de vector zich eindeloos te vermeerderen door de uitgevoerde genetische modificatie, kunnen twee typen virale vectoren tegenover elkaar geplaatst worden.
De propagerende vectoren bestaan ofwel uit een preparaat genetisch gemodificeerde virale partikels competent voor replicatie, zoals vectoren afgeleid van poxvirussen, ofwel uit een mengsel genetisch gemodificeerde partikels deficiënt voor replicatie en « hulp »partikels competent voor replicatie, klassiek het wild type oudervirus. Deze laatste kunnen het gebrek aan replicatie van de vector in trans aanvullen. Dit is bijvoorbeeld het geval voor bepaalde vectoren afgeleid van het Herpesvirus (amplicons). De vereiste inperkingscondities voor de manipulatie van propagerende vectoren zijn ofwel strikter, ofwel gelijkwaardig aan diegene vereist voor de manipulatie van het wild type virus waarvan de propagerende vector is afgeleid en dit al naargelang de gedragen vreemde sequenties of inserten een gevaar vormen of niet.
De niet-propagerende vectoren bestaan uit een a priori zuiver preparaat van virale vectoren deficiënt voor replicatie. Binnen deze categorie vallen het merendeel van de vectoren afgeleid van het retrovirus MLV, de lentivirussen, het Adeno-Associated Virus (AAV) en de adenovirussen. Een vector die niet in staat is zich te vermeerderen blijkt a priori minder gevaarlijk te zijn dan een vector opgebouwd uit dezelfde virale stam maar in staat zich te vermeerderen. De inperkingscondities voor de vectoren deficiënt voor replicatie zijn gelijkwaardig of minder stringent dan deze voor het wild type virus waarvan ze afstammen tenzij de vreemde gedragen sequenties op zichzelf een gevaar vertonen. Ze hangen af van de inschatting van het risico dat deze vectoren incidenteel het vermogen verschaffen zich oncontroleerbaar te vermeerderen. Dit risico verschilt al naargelang men de fase van productie of de fase van het gebruik van de vector beschouwt. De productie beroept zich op transcomplementatie celsystemen die tijdelijk of constitutief de virale genen tot expressie brengen die nodig zijn voor de assemblage en/of de replicatie van de virale partikels. Tijdens die fase is het fenotype dat van een propagerende vector en zijn de risico's voor incidentele vermeerdering gelijkwaardig. De vereiste inperking tijdens die fase is dus dat van een propagerende vector afgeleid van dezelfde virale stam. Buiten de productiefase is er minder risico op verspreiding en kan de inperking minder strikt zijn. Niettemin bestaat er een blijvend risico gebonden aan het mogelijk incidenteel scheppen van transcomplementatiecondities. Tijdens de productiefase kan men een genetische recombinatie met de transcomplementatiesequenties of een contaminatie van het mengsel met wild type viruspartikels vrezen. Gedurende de fase van gebruik wordt de mogelijkheid op een transcomplementatie door een celproteïne, in staat zich in de plaats te stellen van een viraal proteïne, en de mogelijkheid op een infectie door het wild type oudervirus van cellen die de vector hebben opgenomen, in beschouwing genomen. De beoordeling van dit risico houdt rekening met de aard van het virus waarvan de vector afgeleid is, de opbouw van de vector, zijn productiemodaliteiten, het aantal geproduceerde vectorpartikels, het aantal getransduceerde doelwitcellen en van de aard van het gastheerorganisme.
Het deficiënte karakter van de niet- propagerende vectoren kan volgens het aantal virale genen waarvan de functie vernietigd werd door de genetische modificatie min of meer uitgesproken zijn. De kans op een incidentele reversie tot een fenotype competent voor replicatie vermindert met het aantal veranderde functies.
De vectoren die weinig of geen leesfase (« reading frame ») bevatten coderend voor virale proteïnen worden als de meest veilige beschouwd.
De classificatie van een activiteit die gebruik maakt van een virale vector kan van de aard van de virale vector, de aard van de gedragen sequenties en van het beschouwde typegebruik afgeleid worden. Hieronder staan richtsnoeren voor virale vectoren zoals adenovirale vectoren, vectoren afgeleid van retrovirussen, muriene leukemia virussen (MLV), vectoren afgeleid van lentivirussen, vectoren afgeleid van poxvirussen, vectoren afgeleid van afhankelijke (AAV) en autonome (MVM) parvovirussen. Voor de andere vectoren moet de indeling geval per geval bestudeerd worden.
Uitzonderingen op deze indelingsbeginselen zijn :
- de gedragen sequenties coderen voor een bijzonder gevaarlijk proteïne, zoals een toxine,
- de gedragen sequenties zijn in staat een hybride virus te genereren tussen pathogene virussen.
Specifieke gevallen
1. Deficiënte adenovirale vectoren afgeleid van menselijke adenovirussen van het serotype 2 of 5
De oudervirussen zijn pathogene organismen die behoren tot risicoklasse 2 voor de mens en waarvan het gebruik een inperkingsniveau 2 vereist. De productie en het gebruik van vectoren die ervan zijn afgeleid vereist ten minste een inperkingsniveau 2. De met adenovirale vectoren behandelde dieren mogen echter ondergebracht worden in proefdierenverblijven van inperkingsniveau 1 als het insert niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt en indien de afwezigheid van vectoren in de biologische vochten, afscheidingen en uitscheidingen werd aangetoond. Op dezelfde wijze zijn de patiënten in geval van klinische proeven bij de mens niet meer onderworpen aan een inperking nadat de afwezigheid van vectoren in de biologische vochten, afscheidingen en uitscheidingen werd aangetoond. Een inperkingsniveau 3 is vereist voor de productie van de virale vectoren die drager zijn van een insert dat de kans op risico's versterkt en voor alle andere gebruiken van grote hoeveelheden (grote volumes en/of hoge titers) geproduceerde virale suspensies (hanteren van de virale suspensies, celculturen behandeld met deze suspenties, dieren behandeld met deze suspensies).
2. Deficiënte vectoren afgeleid van het muriene leukemia virus (MLV)
Het oudervirus is een pathogeen organisme dat behoort tot risicoklasse 3 voor dieren en waarvan het gebruik een inperkingsniveau 2 vereist. De productie en het gebruik van ecotrope vectoren die ervan zijn afgeleid vereist maximaal een inperkingsniveau 2. De productie en het gebruik van amfotrope vectoren die ervan zijn afgeleid worden ten minste uitgevoerd in een inperkingsniveau 2. De productie en het gebruik in grote hoeveelheden van amfotrope virale vectoren die drager zijn van een insert dat de kans op risico versterkt vereist een inperkingsniveau 3.
De dieren behandeld met retrovirale vectoren mogen ondergebracht worden in proefdierenverblijven van inperkingsniveau 1 indien het insert niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt en indien de afwezigheid van de vector in de biologische vochten, afscheidingen en uitscheidingen werd aangetoond. Op dezelfde wijze zijn de patiënten in geval van klinische proeven bij de mens niet meer onderworpen aan een inperking nadat de afwezigheid van vectoren in de biologische vochten, afscheidingen en uitscheidingen werd aangetoond.
3. Deficiënte vectoren afgeleid van lentivirussen (HIV-1)
Het oudervirus is een pathogeen organisme behorend tot risicoklasse 3 voor de mens.
De productie en het gebruik van de vectoren die ervan zijn afgeleid moeten ten minste uitgevoerd worden in een inperkingsniveau 2. De productie en het gebruik in grote hoeveelheden van virale vectoren die drager zijn van een insert dat de kans op risico's kan versterken vereist een inperkingsniveau 3. Bovendien moet nauwlettend toegezien worden op de manier waarop deze vectoren zijn opgebouwd en in het bijzonder op niveau van de behouden lentivirale sequenties die niet absoluut nodig zijn voor de productie van de vectoren. De gevolgde protocols die de afwezigheid van replicatieve virussen in de bekomen preparaten moeten aantonen dienen aandachtig bekeken te worden.
4. Propagerende vectoren afgeleid van poxvirussen (vaccinia en canarypox ALVAC)
Vaccinia : het oudervirus vaccinia WT wordt ondergebracht in risicoklasse 2 voor mens en dier. Het gebruik ervan vereist een inperkingsniveau 2. De productie en het gebruik van recombinante virussen die ervan zijn afgeleid worden uitgevoerd in een inperkingsniveau 2.
De door deletie sterk verzwakte virale ouderstammen zoals bijvoorbeeld de stam NYVAC worden daarentegen ondergebracht in risicoklasse 1. Het gebruik van de recombinante vectoren die ervan zijn afgeleid kunnen uitgevoerd worden in een inperkingsniveau 1 indien het insert niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt.
Canarypox - ALVAC : de virale ouderstam ALVAC behoort tot risicoklasse 1, het gebruik ervan vereist een inperkingsniveau 1. De productie en het gebruik van de recombinante virussen die ervan zijn afgeleid vereist respectievelijk een inperkingsniveau 1 of 2, naargelang het insert al dan niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt.
5. Vectoren afgeleid van afhankelijke (AAV-2) en autonome (MVM en H-1) parvovirussen
AAV-2 :Het wild type AAV-2 is niet pathogeen en behoort tot risicoklasse 1. Het gebruik ervan vereist een inperkingsniveau 1. De niet-propagerende vectoren die ervan zijn afgeleid vereisen hetzelfde niveau van inperking. In het geval de kans op risico's echter versterkt wordt door de aard van het insert, zal het vereiste inperkingsniveau ten minste 2 bedragen. Indien de productie van AAV-vectoren het gebruik van het wild type adenovirus met zich meebrengt, vereist dit ten minste een inperkingsniveau 2.
MVH en H-1 : deze virussen behoren tot risicoklasse 1 voor de mens en 2 voor dieren. Hun manipulatie vereist een inperkingsniveau 2. De manipulatie van de vectoren die ervan zijn afgeleid vereist eveneens een inperkingsniveau 2. Een inperkingsniveau 1 kan niettemin aangenomen worden indien het gebruikte insert niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt en indien het systeem bestaande uit de vector en de gebruikte transcomplementaire cellen, noch in theorie noch experimenteel aangetoond, replicatie competente virussen (RCV) kan produceren.